Königreich Alpinia

Die DNA-Analyse Teil 1:

Wir zermahlen die Knochen zu Pulver, und geben das Pulver in ein PCR-Reagenzglas. Darin wird anschließend die Erbsubstanz in Lösung herausgelöst. Mit der PCR können winzigste Mengen eines DNA-Abschnitts so stark vervielfältigt werden, dass man sie nach Anfärben sehen kann. Dazu braucht man zunächst einmal Primer. Primer sind selbst kurze DNA-Abschnitte, die als Gegenstück genau auf die die VNTR-Loci flankierenden DNA-Bereiche passen. Diese Anlagerung findet bei einer bestimmten Temperatur sehr schnell statt. Von den Primern aus findet dann die Synthese des gewünschten DNA-Abschnittes durch das Enzym Taq-Polymerase statt. Eine Vervielfältigung des DNA-Abschnittes erfolgt in Zyklen. Bei jedem Zyklus erfolgt eine Verdoppelung des DNA-Abschnittes. Nach 30 Zyklen liegen dann theoretisch 230 Kopien vor. Ein Zyklus besteht aus drei Teilschritten:

1. Zuerst wird der DNA-Doppelstrang bei 95 °C denaturiert.

2. Anschließend werden die beiden Primer bei 60 °C angelagert (Hybridisierung).

3. Das Enzym Taq-Polymerase ergänzt nun bei 72 °C die DNA-Einzelstränge indem sie die DNA-Bausteine komplementär entsprechend der vorhandenen Matrize zusammenfügt (Basenpaarregel).

Die DNA-Analyse Teil 2:

Schon nach wenigen Zyklen wird nur noch der Bereich vervielfältigt, der von den Primern eingerahmt wird. Natürlich werden die Primer so konstruiert, dass sie den gewünschten VNTR-Locus einrahmen.

Die Zyklen laufen automatisch in einem Thermocycler ab. Ein Thermocycler ist ein Heizgerät, das nach entsprechender Programmierung das Reaktionsgemisch in bestimmten Zeiten auf eine gewünschte Temperatur bringt. Das Reaktionsgemisch enthält alle benötigten Komponenten: die zu untersuchende DNA (Template), die für den VNTR-Locus (die Systeme FGA, THO1 oder andere) verantwortlichen beiden Primer, die DNA-Bausteine (Nukleotide), den Reaktionspuffer und das Enzym Taq-Polymerase.

Ist durch die PCR genügend DNA-Material eines Allels (VNTR-Locus) hergestellt worden, so kann mittels Gelelektrophorese die DNA-Länge (Repeat-Anzahl) bestimmt werden. Dabei werden die unterschiedlich großen DNA-Stücke längenabhängig aufgetrennt und anschließend durch Färbung sichtbar gemacht. Zunächst wird ein Polyamidacryl-Gel gegossen, welches man sich als ein System von feinen Poren vorstellen kann. Das PCR-Produkt wird in kleine Geltaschen gefüllt. Durch die feinen Poren wandern dann die DNA-Stücke im elektrischen Feld. Sie tun dies, weil sie in einem Puffer negativ geladen sind. Je kleiner die Fragmente sind, desto schneller wandern sie durch die feinen Poren.

Die DNA-Analyse Teil 3:

Wie weit die Wanderung im Gel fortgeschritten ist, erkennt man an einem Farbstoff (Bromphenolblau und Xylencyanol), den man mitwandern lässt. Die DNA-Stücke werden zum Schluss durch Anfärben mit Silber sichtbar gemacht. Um die Größe der Allele zuordnen zu können, lässt man ein Gemisch aus DNA-Fragmenten mitwandern, deren Größe bekannt ist. Dieser Allelcocktail wird auch Allel-Leiter genannt.

Die in der DNA-Analyse verwendeten Systeme wie vWA, THO 1, FGA oder FES liefern DNA-Fragmente in der Größenordnung von 100 bis 240 bp. Die Allele unterscheiden sich oft nur in 4 bis 6 bp. Um eine verwertbare Analyse zu erhalten, muss mit einem Hochauflösenden Gel elektrophoretisch getrennt werden. Da Polyamidgele engmaschiger sind als Agarosegele, verwendet man diese in der Praxis. Die Banden erscheinen schwarz weil die DNA mit Silber gefärbt wurde. Das Trenngel des Blue Genes Koffer ist allerdings Agarose. Außerdem wird als Färbemittel AzurB-Chlorid anstatt dem empfindlicheren, aber giftigen Ethidiumbromid verwendet. Um ein Ergebnis zu erhalten, wurde im beschriebenen Experiment auf das System D1S80 ausgewichen, dessen DNA-Fragmente 400 – 800 bp groß sind (3,4). Man erreicht so eine individuelle Typisierung. Allerdings können nicht immer 2 Allele erkannt werden, da die Wiederholungssequenzen (Short tandem repeats, STR) nur 16 bp groß sind.

Die DNA-Analyse Teil 4:

Zusätzlich zum Blue Genes Koffer werden benötigt:

• Thermocycler (6)
• Ready-Mix (10,11)
• Paraffinöl (
• PCR-Reaktionsgefäße (7)
• Sterilhandschuhe
• Primer für D1S80 (5)
• InstaGene Matrix (15)
• Steriles Wasser
• Physiologische Kochsalzlösung
• Dampfdrucktopf (Sterilisation)
• Vortex-Gerät (Gerät zum Durchmischen der Proben) (14)
• Zentrifuge (14)
• Wattestäbchen und Skalpell (alternativ zur physiologischen Kochsalzlösung)
• eventuell: BSA ( bovine serum albumin) (15)
• Pipette für 200 µl (9)

Als wir dies alles gemacht haben, vergleichen wir die DNA-Analyse mit einer DNA-Analyse die Kenneth MacAlpin vor seinem Tod abgegeben hatte.

Die Analyse ergab, dass die beiden DNA-Stränge identisch sind. Es waren also die Knochen von Kenneth MacAlpin. Damit dürfte jetzt alles geklärt sein.

Ich bin Physiker, aber da die ganzheitliche Wissenschaft immer wichtiger wird, muss man als Physiker auch über Biologie Bescheid wissen.

Übrigens heute abend so gegen 21:00 Uhr findet die Testaments-Eröffnung von Kenneth MacAlpin statt, soll ich von seinem Notar aus ausrichten.